Les bases du microscope

Le microscope est un instrument optique servant à observer des échantillons de très petite taille, des détails invisibles à l’œil nu. Contrairement aux observations à la loupe binoculaire, les observations au microscope demandent une préparation. L’objet à observer doit être mis entre lame et lamelle et dans un milieu liquide. Il y a également certains réglages à faire avant de commencer vos observations. Généralement les microscopes grossissent entre 20X et 1600X. Cet article vous donnera toutes les bases pour de belles observations.

1 – Terminologie

a)- La tête optique

Elle renferme le système optique des oculaires à l’objectif, porte la sortie trinoculaire et la tourelle porte-objectif.

b)- Les oculaires

L’oculaire est un ensemble de plusieurs lentilles, assimilable à une loupe à fort grossissement. Il grossit l’image fournie par l’objectif. Ils sont généralement caractérisés par deux chiffres qui sont le grossissement et l’indice de champ (cf. paragraphe 2e). C’est à travers les oculaires que vous allez observer vos échantillons.

c)- Le réglage dioptrique

Le réglage dioptrique s’obtient en jouant sur la bague de réglage située sur l’oculaire ou sur le tube qui accueille l’oculaire. Il n’est pas forcément présent sur tous les microscopes et parfois il n’est présent que sur un seul des oculaires.

Ce réglage permet d’adapter la mise au point à votre propre vue dans le cas où vos deux yeux n’ont pas la même acuité.

Si vous utilisez une caméra numérique vous pouvez jouer sur le réglage dioptrique pour que la mise au point entre ce que vous observez à l’oculaire et à l’écran soit identique.

d)- La tourelle porte-objectif et les objectifs

La tourelle porte-objectifs, aussi appelée revolver, peut accueillir 3 ou 4 objectifs selon le modèle de microscope. Ceux-ci sont simplement vissés sur la tourelle et peuvent être facilement changés.

L’objectif d’un microscope fonctionne de la même manière qu’un objectif photo : c’est un système de lentilles qui collectent la lumière renvoyée par un objet pour la focaliser sur un plan, point par point, afin de créer une image de l’objet qui sera grossie par les lentilles de l’objectif et des oculaires. Un oculaire est caractérisé par le grossissement, l’ouverture numérique et le pouvoir séparateur (cf. paragraphe 2f et 2g).

Pour atteindre les forts grossissements, il est nécessaire d’utiliser un objectif à immersion qui donnera une meilleure résolution. Avant d’utiliser cet objectif, la préparation doit être reconnue avec les objectifs secs. Après avoir centré la préparation sur la platine, descendez celle-ci à l’aide de la molette de réglage macro métrique, mettez une goutte d’huile sur le point à observer, faites tourner la tourelle porte-objectifs pour amener l’objectif à immersion (100X) dans l’axe optique. Montez tout doucement la platine du microscope à l’aide de la molette de réglage macro métrique jusqu’à ce que l’objectif soit en contact avec l’huile. Puis, observez à l’oculaire et faites la mise au point avec la molette de réglage micrométrique. Cette opération est délicate et demande beaucoup de soins et de méthode, car vous pouvez facilement briser la lame ou abimer l’objectif. C’est pour cela que certains objectifs ont un système de sécurité.

e)- L’écartement interpupillaire

Sur certains modèles de microscopes, vous pouvez jouer sur l’écartement entre les deux tubes optiques en les rapprochant ou en les écartant l’un de l’autre. Ce réglage vous permet d’observer un seul cercle dans le champ et d’être à l’aise lors de vos observations.

f)- La molette de mise au point

C’est elle qui vous permet de régler la netteté de l’image lorsque vous observez votre préparation. Sur la majorité des modèles il y a une mise au point macro métrique et une mise au point plus fine (micrométrique).

g)- La platine porte-lame

C’est elle qui reçoit la lame avec la préparation, elle est percée par un orifice central pour laisser passer la lumière. Sur les modèles d’initiation, la platine est immobile et la lame est tenue par des valets. Sur les modèles de la gamme au-dessus, il y a sur la platine, ce que l’on appelle une sur-platine capable de mouvements dans deux plans perpendiculaires de l’espace (mouvements orthogonaux). Les microscopes polarisants portent en général une platine et une sur-platine ronde et tournante. Pour les modèles de microscope très sophistiqués, et selon l’application, il existe d’autres types de platines.

h)- La sortie trinoculaire

Il existe plusieurs types de microscope caractérisés par le nombre de sorties visuelles : monoculaire, binoculaire et trinoculaire. Le monoculaire et le binoculaire ont des sorties visuelles qui servent uniquement à l’observation directe : les oculaires, un ou deux selon le modèle. Sur le microscope trinoculaire il y a, en plus des deux oculaires, une troisième sortie visuelle (la sortie trinoculaire) qui permet d’adapter une caméra numérique ou un appareil photo.

i)- La vis de blocage de la tête optique

Tous les microscopes n’en sont pas forcément équipés, mais lorsqu’une rotation de la tête optique est possible, sur 180 ou 360°, il y a souvent une vis qui permet de bloquer la tête dans la position désirée.

j)- Le condenseur

Constitué d’une lentille, le condenseur est l’élément qui concentre et dirige le faisceau de lumière sur l’échantillon (en éclairage transmis, cas de la grande majorité des microscopes). Situé sous la platine du microscope il peut être déplacé vers le haut ou vers le bas, donc plus ou moins proche de la platine. Son bon réglage est très important (cf. paragraphe 2i) et ses caractéristiques sont liées au mode d’observation.

k)- Le diaphragme de champ

Situé à la base du statif (en général), il contrôle la taille du champ éclairé sur l’échantillon. Il est généralement constitué de lamelles souples qui forment un iris.

l)- Le diaphragme d’ouverture

Généralement situé sur le condenseur, son ajustement dépend de l’objectif utilisé et permet de compenser le manque de profondeur de champ de certains objectifs.

2 – Notions de base

a)- Calcul du grossissement

Le grossissement de ce que vous observez est égal au grossissement des oculaires multiplié par le grossissement de l’objectif utilisé. Par exemple pour un microscope dont les oculaires grossissent 10X et l’objectif utilisé grossit 4X le grossissement final est égal à 10×4=40X.

Formule : G_objectif x G_oculaires

b)- Mise au point

Pour les observations, placez vos yeux près des oculaires, réglez l’écartement interpupillaire de manière à obtenir un seul cercle dans le champ d’observation et placez votre lame sur la platine. Commencez au grossissement le plus faible (en général 40X) : Tournez la tourelle porte-objectifs pour positionner l’objectif 4X au-dessus de la lame. Centrez l’observation en manipulant la lame directement ou la commande des mouvements orthogonaux de la sur-platine, si votre microscope en dispose. Effectuez la mise au point précise en actionnant la molette de mise au point (réalisez en premier lieu le réglage macro métrique puis le micrométrique) jusqu’à l’obtention d’une image nette.

Pour adapter la mise au point à votre vue, vous pouvez réaliser le réglage dioptrique :

– fermez un des deux yeux, modifiez la mise au point si elle n’est pas nette pour cet œil.

– changez d’œil et vissez ou dévissez la bague de réglage à la base de l’oculaire, ce qui aura un effet sur la netteté de l’image et adaptera la mise au point à votre propre vue.

Vous pouvez ensuite passer aux grossissements plus forts en tournant la tourelle porte-objectifs.

c)- Notion de distance de travail

La distance de travail est la distance entre l’objectif et l’échantillon pour laquelle l’image est nette, elle dépend de l’ouverture numérique de l’objectif (cf. paragraphe 2f).

d)- Notion de profondeur de champ

La profondeur de champ correspond à l’épaisseur de l’échantillon pour laquelle l’image est nette. Lorsque vous êtes net pour un plan de l’objet que vous observez, tout ce qui est au-dessus ou en dessous de ce plan (au-delà de la zone où la mise au point reste nette) sera floue. C’est ce paramètre qui est utilisé par les photographes pour mettre en avant un sujet et que le fond derrière ou devant le sujet soit flou.

Plus le grossissement est grand, moins la profondeur de champ est importante.

e)- Champ observé

Le champ observé, ou plage d’observation, dépend de l’indice de champ de l’oculaire et correspond sur l’échantillon au diamètre (en millimètres) de la zone que vous pouvez voir à travers les oculaires. L’indice de champ des oculaires est le deuxième chiffre présent sur l’oculaire. Par exemple, des oculaires avec l’inscription 10X/22 indiquent un indice de champ de 22mm. Pour calculer le champ observé, il vous suffit de diviser l’indice de champ de l’oculaire par le grossissement de l’objectif utilisé. Si un microscope possède des oculaires qui ont un indice de champ de 20, avec l’objectif 4X par exemple, alors le diamètre de la zone que vous allez observer est égal à 20/4=5mm.

Plus le grossissement est important, moins le champ observé est grand.

f)- Ouverture numérique

Cette dimension sans unité caractérise les objectifs de microscope. L’ouverture numérique représente la gamme d’angles pour laquelle l’objectif est capable d’émettre et de recevoir de la lumière.

Ce paramètre influence la distance de travail, la profondeur de champ et le pouvoir séparateur de l’objectif : plus l’ouverture numérique est élevée, plus la distance de travail et la profondeur de champ sont faibles et plus le pouvoir séparateur est important.

g)- Le pouvoir séparateur ou résolution

Cette valeur représente la capacité d’un objectif à distinguer deux points distincts et est définie comme la distance angulaire minimale entre deux éléments qui permet d’en obtenir deux images distinctes. La résolution maximale qu’il est possible d’obtenir aujourd’hui en microscopie optique est de 0,24µm, c’est-à-dire que l’on peut distinguer sur un échantillon deux points distants l’un de l’autre de 0,24µm. Si deux points sont distants l’un de l’autre de seulement 23µm ils seront alors vus comme un seul point.

h) – Aberration chromatique et aberration sphérique

La lumière est composée d’ondes électromagnétiques possédant différentes caractéristiques et notamment la longueur d’onde. A une couleur, correspond une longueur d’onde donnée. La lumière blanche qui passe à travers une lentille se décompose en différentes longueurs d’ondes (en différentes couleurs) et ces différentes longueurs d’ondes ne se projettent pas sur le même plan focal. C’est ce que l’on appelle une aberration chromatique. Certains objectifs sont fabriqués pour corriger cette aberration, on les appelle objectifs achromatiques (corrigés sur deux couleurs) et apochromatiques (corrigés sur trois couleurs).

Une autre aberration rencontrée dans le monde de l’optique est ce que l’on appelle l’aberration sphérique : lorsque l’on regarde à travers une lentille, on peut remarquer que ce que l’on voit sur les bordures du champ observé est courbé alors que le centre de l’observation est plat. Pour corriger cette aberration optique il faut utiliser des objectifs dits semi-plans (planéité sur 90% de la surface) ou plans (planéité sur 100% de la surface).

Bien évidemment, plus un objectif corrige d’aberration, plus son prix est élevé.

i) – Le réglage de Koehler

Avant toute observation, vous devez réaliser ce réglage qui permet un éclairage homogène et contrasté de la préparation. Certains microscopes (les microscopes d’initiation et d’entrée de gamme) sont déjà préréglés et il est impossible de faire le réglage de Koehler, car le condenseur est fixe et non réglable. Vous pouvez réaliser ce réglage avec ou sans préparation.

Placez-vous au grossissement le plus faible, ouvrez le diaphragme d’ouverture (figure 1) et fermez le diaphragme de champ (figure 2) pour visualiser une forme polygonale floue et non centrée (figure 3) (ce polygone n’est autre que l’orifice minimale laissant passer la lumière).

Modifiez la hauteur du condenseur grâce à la molette indiquée en figure 4 jusqu’à ce que ce polygone devienne le plus petit et le plus net possible.

Centrez ensuite ce polygone à l’aide des vis de centrage du condenseur (figure 5).

Ouvrez le diaphragme de champ jusqu’à ne plus voir le polygone lumineux (figure 6). Fermez le diaphragme d’ouverture pour contraster l’image, si besoin.

Votre microscope est maintenant prêt pour faire de belles observations du monde de l’infiniment petit.

j) – Evolution du matériel

Selon le modèle que vous avez choisi, vous pouvez faire évoluer votre microscope en changeant les oculaires ou les objectifs pour modifier le grossissement ou améliorer la qualité des observations. Vous pouvez utiliser une caméra numérique sur votre microscope, qu’il soit mono-, bino- ou trinoculaire.

Ainsi un microscope n’est pas figé dans le temps et vous pourrez approfondir vos observations.

Nous espérons que ces notions vous aideront dans vos futures observations et n’hésitez pas à nous contacter pour des questions, nous serons ravis de vous conseiller.